ПЦР — современный метод молекулярной биологии, который используется для обнаружения ДНК и РНК патогенов в биологическом материале. Его особенности включают в себя высокую чувствительность и специфичность, а также быстроту получения результатов.
В настоящее время этот метод широко применяется для диагностики COVID-19.
Изобретателем полимеразной цепной реакции был ученый-биохимик Кэри Муллис в 1983 году. Спустя 10 лет он был удостоен Нобелевской премии по химии.
Принцип работы ПЦР
В процессе эксперимента пробирку с биоматериалом помещают в специальные условия, при которых молекулы нуклеиновой кислоты (двунитевая ДНК, присутствующая в образце или синтезированная из однонитевой РНК), содержащие генетическую информацию определенного патогена, увеличиваются в количестве. Если в исследуемой пробе имеется хотя бы небольшое количество патогенных частиц, то через несколько часов их число вырастет до десятков и даже сотен миллионов. Это облегчает обнаружение возбудителя инфекции или генетических нарушений при низком риске получить ложноотрицательный результат.
Молекула ДНК
Виды полимеразной цепной реакции
ПЦР — перспективное направление исследований. Ученые постоянно совершенствуют методики проведения реакции и создают новые подходы, приспосабливая ПЦР для различных задач.
В лабораторной практике применяются два важных метода — ПЦР в режиме реального времени и ПЦР с обратной транскрипцией.
Используя ПЦР в режиме реального времени (количественный), можно не только обнаружить патогенные молекулы ДНК, но и подсчитать их количество. Это помогает определить степень заражения, дозировку лекарств и продолжительность приема.
ПЦР с обратной транскрипцией используется, когда искомым генетическим материалом является РНК вируса, а не ДНК.
Дело в том, что у некоторых патогенов, например у вируса гепатита C, генетический материал представлен только РНК — однонитевой цепью нуклеотидов, в отличие от двунитевой ДНК-молекулы. РНК также несет генетическую информацию, но не подходит для стандартной ПЦР.
Для проведения исследования, вторую цепь РНК-молекулы восстанавливают с помощью специального фермента — обратной транскриптазы. Таким образом, РНК преобразуется в ДНК-молекулу, готовую к последующему копированию с использованием стандартной ПЦР или ПЦР в реальном времени.
Процесс ПЦР
Необходимое для ПЦР
Для выполнения полимеразной цепной реакции требуется специальный прибор — амплификатор. Он поддерживает необходимую температуру для каждого этапа и выполняет циклы копирования ДНК — амплификацию. Когда количество молекул достаточно для распознавания, оборудование анализирует их, и затем предоставляет качественные или количественные результаты.
Пробирки с биоматериалом, подготовленным для ПЦР, в амплификаторе
Для проведения ПЦР, помимо амплификатора, необходимо иметь определенные компоненты:
- Требуемая ДНК — это участок ДНК искомого патогена, с уникальной последовательностью нуклеотидов. Например, при анализе на герпес с помощью ПЦР используется тот участок ДНК, который отличает герпес от других вирусов. Также эту ДНК иногда называют матрицей ДНК.
Цепи ДНК и РНК состоят из маленьких «звеньев» — нуклеотидов. Их последовательность формирует генетический код, несущий генетическую информацию.
- Два праймера — это короткие нити из нуклеотидов, которые точно соединяются с целевыми нитями ДНК, подобно элементам головоломки. Новые молекулы ДНК образуются на основе этих праймеров в процессе ПЦР. Если праймеры не соединились, значит, искомой ДНК в исследуемом биоматериале нет.
- ДНК-полимераза — это фермент, который строит новые цепи ДНК во время проведения ПЦР.
- Дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ) — это смесь нуклеотидов, которая служит строительным материалом для копирования молекул ДНК.
- Ионы магния (Mg2+) — поддерживают активность ДНК-полимеразы в процессе ПЦР.
- Буферный раствор — это смесь, которая создает оптимальные условия для биохимической реакции.
Этапы полимеразной цепной реакции
ПЦР включает в себя три основных этапа.
Вначале выполняется нагревание пробы, в результате чего все ДНК-молекулы, содержащиеся в биоматериале, распадаются на две цепи РНК. Этот процесс именуется денатурацией.
Если генетический материал патогена – РНК, а не ДНК, то перед денатурацией проводится ПЦР с обратной транскрипцией. Этот подход позволяет преобразовать РНК в молекулу ДНК.
Затем температуру снижают. Если в пробе содержится целевая ДНК, праймеры присоединяются к концам ее цепей – так происходит отжиг.
По завершению отжига фермент ДНК-полимераза активируется и приступает к синтезу второй цепи ДНК, начиная с праймера. Для синтеза цепи ДНК полимераза использует дНТФ. Последний этап именуют элонгацией.
При проведении Полимеразной цепной реакции происходит более 30 циклов копирования (амплификации). В результате каждого цикла количество ДНК-цепей увеличивается вдвое. Так, если на первом цикле было 2 цепи ДНК, то на втором уже 4, на третьем — 8, и так далее.
Какие болезни можно выявить с помощью ПЦР
Каждый патоген — бактерия, вирус или гриб — содержит уникальные РНК- или ДНК-молекулы.
По наличию этих молекул в биоматериале можно быстро и точно диагностировать заражение болезнетворными микроорганизмами. Однако есть важное условие: у ПЦР-исследования должна быть цель — конкретный патоген, наличие которого нужно подтвердить или опровергнуть. Как правило, цель ПЦР определяет врач на основании осмотра, инструментального обследования и жалоб пациента.
Вирусные инфекции
Все вирусы обладают либо ДНК-, либо РНК-молекулами. Метод ПЦР способен выявить их в организме, а ПЦР в реальном времени также может измерить количество увеличенных копий. Результат анализа ПЦР может помочь врачу поставить диагноз, определить стадию заболевания, подобрать нужное лекарство и определить длительность курса лечения.
Бактериальные инфекции
У всех бактерий, также как и у вирусов, есть ДНК-молекулы, которые можно обнаружить с помощью ПЦР.
Однако не все бактерии, в отличие от вирусов, являются вредными. Например, условно-патогенные бактерии при определенных условиях полезны для организма. Но если их количество становится слишком большим по каким-либо причинам, возникает бактериальный дисбаланс – дисбактериоз. Это состояние негативно сказывается на здоровье.
Чаще всего условно-патогенные микроорганизмы становятся причиной развития кожных, кишечных и гинекологических заболеваний. Для определения их присутствия используют качественную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и ПЦР в реальном времени — это позволяет определить, превышает ли количество микроорганизмов норму, и если да, то насколько значительно.
Исходя из результатов такого анализа, врач может рассчитать необходимую дозировку и продолжительность приема лекарств, необходимых для восстановления нормальной микрофлоры.
Грибковые инфекции
В большинстве случаев для диагностики грибковых инфекций используют микроскопию: визуально обнаружить грибок не составляет труда, особенно при наличии выраженных симптомов.
Однако в некоторых ситуациях, например, при кандидозе (молочнице), широко применяется ПЦР. Это обусловлено двумя основными причинами.
Прежде всего, кандидоз вызывается условно-патогенным грибком кандида. Он становится патогенным только в случае излишнего размножения.
ПЦР в режиме реального времени помогает определить насколько активно размножается кандида, и подобрать оптимальную дозу препарата, чтобы уменьшить их количество.
Во-вторых, слизистые оболочки урогенитального тракта, влагалища и рта населены различными микроорганизмами. ПЦР в данном случае является более точным методом диагностики благодаря своей направленности.
Области применения ПЦР
Поскольку генетический код присутствует у всех живых организмов, метод ПЦР используется повсюду, где требуется увеличение количества ДНК- и РНК-молекул. Например, для извлечения генетического материала с места преступления или выявления конкретных генетических мутаций.
ПЦР в установлении родства
Для установления связи по родству может понадобиться увеличение количества ДНК методом амплификации, если материала недостаточно. Большое количество биоматериала обеспечит более точные результаты исследования, позволяя определить пол, вид или родство как у живых, так и у мертвых организмов.
ПЦР для выявления наследственных предрасположенностей
Метод ПЦР позволяет обнаружить определенные гены, ответственные за склонность человека к различным состояниям (например, к лишнему весу) или заболеваниям.
Такие исследования проводятся, если пациенту необходим план профилактических мер против развития заболеваний.
ПЦР в диагностике генетических мутаций
Еще один пример использования полимеразной цепной реакции — обнаружение мутаций в генах, которые могут повлиять на эффективность лечения различных заболеваний. Например, при бронхиальной астме или сердечной недостаточности результаты анализа гена бета-2-адренорецептора ADRB2 могут помочь врачу подобрать оптимальное лечение.
Кроме того, некоторые изменения в генах могут служить индикаторами онкологических заболеваний. Обнаружение их позволяет специалистам выбрать наиболее эффективное лечение и предсказать дальнейшее развитие патологий.
Применение ПЦР в судебно-медицинской экспертизе и криминалистике
Одним из узких направлений использования генетических ПЦР-тестов является сфера расследований.
Большинство ДНК у различных людей одинаково, но остаточные 0,1% составляют уникальный генетический код, который различает людей между собой. Поиск и сравнение этих уникальных частей позволяют идентифицировать преступников или жертв.
ПЦР может использоваться в тех ситуациях, когда генетического материала недостаточно для точного анализа. Например, если найдены разложившиеся останки тела или тело сильно обгорело и его нельзя идентифицировать.
При поиске преступников генетический материал может помочь доказать вину подозреваемого. ПЦР позволяет извлечь ДНК из любых биологических «следов», которые мог оставить злоумышленник. Подойдут кровь, слюна, моча, волосы, семенная жидкость, кожа под ногтями жертвы. Из отпечатка пальца тоже можно извлечь ДНК.
Отпечаток пальца содержит приблизительно 10 нанограмм ДНК. Для проведения исследования необходимо всего 0,1 нанограмма.
ПЦР в ветеринарии
Ветеринары применяют ПЦР аналогично врачам: для постановки диагноза у животных с различными инфекционными заболеваниями, а также для оценки эффективности лечения.
У диких и бродячих животных ПЦР помогает выявить патогены, которые могут передаваться человеку и вызывать опасные заболевания. Например, бешенство, чуму, некоторые формы гриппа, оспу и другие.
ПЦР в растениеводстве
Для выявления фитопатологий — болезней растений — также используется полимеразная цепная реакция. Этот метод позволяет обнаружить вирусы, бактерии и грибы, которые могут привести к частичному или полному уничтожению урожая.
Проблемой применения ПЦР в сельском хозяйстве является стоимость оборудования, которая недоступна для всех фермерских хозяйств, а также высокая чувствительность метода. Если образец содержит даже небольшое количество патогена, результат анализа будет положительным.
Данная особенность требует более тщательной подготовки растительного материала к исследованию, а также создания стерильных условий в лаборатории и проведения дополнительных проверочных тестов.
Применение ПЦР в контроле потребительских продуктов
ПЦР может применяться для контроля наличия генно-модифицированных организмов (ГМО), которые часто содержатся в пищевых продуктах и различных кормах.
Генетически модифицированные организмы создаются при помощи генной инженерии — изменения исходного генетического кода организма и внедрения в него полезных свойств. Это помогает адаптировать растения к неблагоприятным условиям, защитить их от вредителей и химических веществ, а также ускорить их рост или увеличить урожайность.
Полимеразная цепная реакция позволяет многократно копировать успешные ДНК-молекулы, выявлять ГМО и создавать миллионы копий для дальнейшего использования или для проведения новых экспериментов и исследований.
Преимущества ПЦР
ПЦР считается одним из наиболее эффективных способов выявить наличие инфекции. Этот метод является точным — он позволяет обнаружить нужный патоген даже при низкой концентрации в образце.
Кроме того, результаты ПЦР не зависят от иммунной реакции организма, особенностей культивирования патогена или стадии инфекции.
Точность
Критерии точности ПЦР включают в себя чувствительность и специфичность.
Чем меньше вероятность получить ложноотрицательный результат, тем выше чувствительность метода.
Чувствительность ПЦР составляет от 90 до 100% — с такой вероятностью анализ обнаружит патоген, если он действительно присутствует в образце.
По сравнению с полимеразной цепной реакцией, другие методы менее чувствительны. Например, чувствительность иммуноферментного анализа составляет от 50 до 70%, а культурного исследования — от 60 до 80%.
Чем меньше вероятность ложноположительного результата, тем выше специфичность метода.
Специфичность ПЦР достигает 100%. Если в биоматериале отсутствует подходящая РНК или ДНК, то реакция не произойдет.
Культуральный метод обладает высокой специфичностью, но он менее чувствителен, что снижает его общую точность.
В отличие от ПЦР и культурального метода, иммуноферментный анализ обнаруживает антитела — специальные белки, которые организм производит для борьбы с патогеном, а не сам патоген.
После прохождения болезни антитела могут вызвать кросс-реакцию с другими видами антител. Например, при анализе на болезнь Лайма положительный результат может быть вызван антителами к вирусу инфекционного мононуклеоза и другим герпес-вирусам. В обоих случаях результат может быть ошибочным, так как пациент фактически не заражен искомым патогеном или заражен чем-то другим.
Таким образом, высокая чувствительность и специфичность полимеразной цепной реакции делают ее одним из наиболее точных методов лабораторной диагностики.
Скорость
В большинстве случаев результат анализа методом ПЦР можно получить за один день.
Срок готовности результатов культурного метода посева обычно составляет от двух до трёх дней.
Результат иммуноферментного анализа обычно готов примерно через два дня.
Отсутствие зависимости от особенностей патогена
По сравнению с другими методами лабораторной диагностики, ПЦР не зависит от определенных характеристик патогенов.
Например, культурный метод (посев) заключается в выращивании бактерий и грибов на специальной питательной среде.
Если в образце были микроорганизмы, их количество будет увеличиваться со временем и станет заметным даже без микроскопа.
Однако некоторые микроорганизмы сложно выращивать в культуре. Например, боррелии и бледная трепонема очень требовательны к условиям окружающей среды и посеву, что делает невозможным использование этого метода для лабораторной диагностики болезни Лайма и сифилиса.
Риккетсии и хламидии, являющиеся внутриклеточными паразитами, в целом не могут быть выращены в лабораторных условиях, а шигеллы и сальмонеллы не всегда активны и в определенные моменты не размножаются.
Применение метода ПЦР не зависит от особенностей культивирования грибов и бактерий. Более того, с помощью ПЦР можно исследовать также вирусы.
Колонии бактерий, выращенные культурным методом
Отсутствие зависимости от иммунной реакции и наличия симптомов
Определение инфекции основано на наличии у пациента антител к возбудителям. Если заражение произошло недавно, инфекция может протекать скрыто или у пациента могут быть нарушения в иммунной системе, что может привести к ложным результатам при серологическом исследовании.
Например, антитела к возбудителю гепатита B начинают появляться только через 1-3 месяца после инфицирования. Поэтому раннее обнаружение болезни с помощью анализа на антитела может быть неэффективным.
Также у некоторых пациентов иммунная система не производит антитела при подтвержденной инфекции с ПЦР. Например, это может случиться при клещевом энцефалите.
ПЦР, наоборот, не зависит от иммунной реакции, и с его помощью можно диагностировать заболевание на самом раннем этапе — до появления антител и первых симптомов.
При проведении около 50% серологических тестов на гепатит B в инкубационном и начальном периодах наблюдается ложноотрицательный результат при положительной ПЦР.
Как и в случае многих других инфекционных заболеваний, ранняя диагностика гепатита играет ключевую роль. Она позволяет сразу начать лечение, сократить негативные последствия заболевания и предотвратить дальнейшее распространение инфекции. Поэтому использование ПЦР является предпочтительным методом исследования.
Недостатки метода ПЦР
Ограниченная специфичность
ПЦР нацелена только на один патоген, генетический материал которого копируется. В случае микст-инфекции (заражение несколькими патогенами одновременно) метод ПЦР обнаружит лишь тот патоген, на который направлен анализ. Дополнительные вирусы или бактерии не будут обнаружены вместе с целевым инфекционным агентом.
Чувствительность оборудования
Оборудование для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) является чрезвычайно чувствительным и требует высокого уровня стерильности как в процедурном кабинете, так и в самой лаборатории.
Cвыше 70% ошибочных результатов ПЦР связаны с несоблюдением правил подготовки образцов.
Если образец случайно загрязнится в процессе взятия, транспортировки или добавления реагентов, результат исследования может оказаться неточным.
Подготовка к процедуре анализа методом ПЦР
Основной задачей при взятии биоматериала для ПЦР является предотвращение загрязнения. Для этого необходимо точно соблюдать все правила подготовки.
Как подготовиться к анализу ПЦР крови
- Кровь следует сдавать натощак, с 8 до 11 часов утра. В течение дня значения крови могут изменяться, наиболее точными являются результаты утреннего анализа.
- За 24 часа до теста необходимо избегать употребления алкоголя и воздерживаться от интенсивных физических нагрузок.
- За 8 часов до взятия крови не следует употреблять пищу и жидкости, кроме негазированной воды. Накануне анализа рекомендуется ужинать легкой, нежирной пищей.
- За 1–2 часа до анализа желательно не курить, избегать стресса и физической активности (бег, быстрый подъем по лестнице).
- За 15 минут до взятия крови стоит немного отдохнуть: сесть в лабораторном кресле, успокоиться.
- За 1–2 дня до анализа следует исключить из рациона продукты с высоким содержанием жиров. За 2 дня до сдачи крови на вирусные гепатиты следует исключить из рациона цитрусовые, апельсины и оранжевые фрукты.
Порядок взятия крови у детей:
Для проверки данных в процессе развития следует проходить анализ в одинаковых условиях: в той же лаборатории, в течение того же времени суток.
Медикаменты и медицинские процедуры могут повлиять на результат анализа.
Не рекомендуется сдавать кровь непосредственно после физиотерапевтических процедур, инструментального обследования, рентгенологического или ультразвукового исследования, массажа.
Наилучшее время для анализа крови — до начала приема медикаментов или через 10–14 дней после отмены. Об употребляемых препаратах следует предупредить медсестру, и также доктора, который проводит диагностику или определяет лечение.
Инспекции для оценки результативности курса терапии обычно проводят через 1–2 недели после последнего приёма лекарства.
Подготовка к ПЦР-проверке мочи
За 24 часа перед процедурой следует исключить из диеты продукты, влияющие на цвет и химический состав мочи: алкоголь, овощи, изменяющие оттенок мочи, такие как свекла и морковь, а также специи и соль. Перед проведением анализа лучше всего проконсультироваться с врачом относительно отмены мочегонных средств.
Перед сбором биоматериала необходимо тщательно очистить наружные половые органы.
Женщинам рекомендуется обработать половые губы ватными тампонами: сначала — смоченными в тёплой воде с мылом, затем — смоченными в чистой воде.
Тампоны нужно двигать от промежности к заднему проходу. Лишнюю влагу необходимо удалить салфеткой.
Для мужчин важно тщательно промыть отверстие мочеиспускательного канала теплой водой с мылом, оттянув кожный складку, промыть водой и промокнуть чистой салфеткой.
Биоматериал нужно собрать в одноразовый стерильный контейнер. Его можно получить бесплатно в любом лабораторном отделении Гемотест.
Инструкция по использованию контейнера
- Откройте крышку контейнера и положите её, не касаясь внутренней части крышки.
- Соберите первую порцию мочи в контейнер.
- Если биоматериал собирается у ребенка, можно использовать мочеприемник.
- Закройте контейнер крышкой и плотно закрутите её.
- Доставьте контейнер в лабораторное отделение в течение 2 часов после взятия биоматериала.
Подготовка к ПЦР-анализу кала
Прежде чем начать прием антибиотиков, стоит сдать анализ кала или же подождать минимум 12 часов после приема лекарства.
Откажитесь от использования ректальных свечей и масел, слабительных средств и клизм за 72 часа до сдачи анализа, а также временно прекратите прием лекарств, влияющих на работу кишечника и цвет кала.
После естественного опорожнения кишечника без применения клизм или слабительных средств соберите образец кала.
Обратите внимание, что в кал не должны попасть иностранные вещества, такие как вода, моча, выделения половых органов, дезинфицирующие средства и химические вещества из подгузников:
- Перед сбором кала вымойте и обсушите промежность;
- Собирайте кал с чистой и водонепроницаемой поверхности: для этого подойдет чистый полиэтиленовый пакет, пленка, чистое судно или горшок.
Нельзя собирать образцы из унитазов, пеленок или подгузников!
Разложите 1-2 чайные ложки материала в герметичный контейнер. Если требуется провести несколько анализов, приготовьте отдельные образцы для каждого исследования в отдельных контейнерах.
Доставьте контейнер в лабораторию в течение 2 часов после сбора. Чтобы сохранить температуру, можно поместить его в термос с льдом или в пакет с хладоэлементами.
Для последовательного контроля показателей сдавайте каждый анализ в одинаковых условиях: в том же лабораторном отделении, с использованием того же метода.
Исследования для оценки эффективности лечения, как правило, проводят через 2-4 недели после курса антибиотиков.
Подготовка к анализу ПЦР слюны
Для проведения ПЦР-анализа мокроты необходимо отказаться от приема лекарственных препаратов в течение 24 часов после согласования с лечащим врачом.
За 3 часа до проведения исследования рекомендуется воздержаться от курения, приема пищи, а также проведения гигиены полости рта (в том числе полоскание, чистка зубов, использование освежителей для рта, сосание леденцов и жевательной резинки).
Подготовка к проведению ПЦР-анализа мокроты
- Перед проведением исследования необходимо прекратить прием антибиотиков и иммуномодуляторов за две недели по рекомендации врача.
- Для сбора мокроты рекомендуется использовать утренний биоматериал, сначала тщательно чистить зубы и прополаскивать рот, не употреблять пищу перед взятием пробы.
- Необходимо собирать именно мокроту, а не слюну или слизь из носоглотки. Для этого делайте несколько глубоких вдохов, чтобы вызвать кашель с отделением мокроты из глубоких дыхательных путей.
- Собранную мокроту следует выплевывать в заранее подготовленный стерильный контейнер с плотно закрывающейся крышкой. Объем пробы должен быть не менее 1 мл.
- Принесите контейнер с мокротой в лабораторию в день взятия пробы.
Подготовка к взятию мазка из зева
Получив заранее разрешение у лечащего врача за 24 часа до проведения исследования, следует отказаться от приема лекарств для полости рта.
За 3 часа до исследования рекомендуется не курить, не употреблять пищу и не проводить гигиену полости рта (полоскание, чистка зубов, использование освежителей для рта, сосание леденцов, жевательная резинка).
Подготовка к соскобу из влагалища или урогенитального тракта
За 30 дней до исследования необходимо прекратить прием антибиотиков по согласованию с лечащим врачом.
За 24 часа до исследования не следует делать спринцевание, использовать внутривагинальные препараты (свечи, тампоны), применять антисептические средства (в том числе мирамистин), исключать половой контакт.
В день исследования запрещается проводить гигиену половых органов.
Женщинам стоит сдавать анализ до даты начала менструации или через 5 дней после ее завершения.
Мужчинам рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 3 часов (15-20 минут в случае обильных уретральных выделений) перед взятием материала.
Видео по теме:
Вопрос-ответ:
Что такое метод ПЦР?
Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это биохимический метод, который позволяет в несколько раз увеличить количество ДНК или РНК в образце за счет их многократного копирования.
Зачем используется метод ПЦР?
Метод ПЦР используется для диагностики инфекционных заболеваний, исследования генетических отклонений, идентификации ДНК организмов, проведения форензических исследований, а также для многих других целей в медицине, науке и практике.
Как происходит проведение метода ПЦР?
Для проведения метода ПЦР требуется набор реакционной смеси, содержащей фермент ДНК-полимеразу, праймеры (короткие одноцепочечные фрагменты ДНК), дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ) и исследуемый образец с целевой последовательностью ДНК или РНК. Смесь нагревается и охлаждается в специальном термоциклере, что позволяет происходить различные этапы амплификации ДНК (разделение, связывание, продление).
Какие преимущества и недостатки имеет метод ПЦР?
Преимущества метода ПЦР включают высокую чувствительность, специфичность, скорость и возможность автоматизации. Однако недостатками являются возможность возникновения ложноположительных и ложноотрицательных результатов, а также требование четкого контроля за условиями проведения реакции, чтобы избежать загрязнения и контаминации.
